BIO Industry_2016.12. 특집 (p3~10)

재생의료용 배양기기와 재료

●다능성 줄기세포 스페로이드의 고밀도 형성 및 배양용 미세가공용기 <EZSPHERE®>
(Microfabric vessels <EZSPHERE®> for high-density spheroid formation and cultivation of pluripotent stem cells)
Tatsuaki Miwa 외 1인 / Asahi Glass㈜ 첨단기술연구소 연구원

ES/iPS세포 등 다능성 줄기세포를 이용하여 재생의료를 실현화하기 위해서는, 세포의 대량배양기술의 개발이 필수다. 본고에서는 iPS세포에서 균일한 스페로이드를 단시간에 대량으로 형성시켜, 고품질이며 효율적으로 배양∙분화가 가능한 유니크한 세포 모양을 지닌 미세가공 배양용기 「EZSPHERE®」와, 그것을 이용하여 독자적으로 개발한 3차원 배양∙분화 기술에 대해 소개한다.

1. 머리말
인간 ES/iPS세포 등 다능성 줄기세포는, 무한한 증식기능과 다양한 세포 종으로 분화하는 다능성을 보유하고 있어, 재생의료나 신약개발 세포 소스로서 기대를 모으고 있다. 그 실현화를 위해서는, 우선 ES/iPS세포의 대량배양기술 개발이 필수다. 한편 그들 세포는 강한 대사활성과 높은 분화 포텐셜을 보유한 반면에 불안정한 측면도 있다. 그렇기 때문에 세포 본래의 다능성(미분화 상태)을 유지한 채 고품질로 또한 안정적으로 배양하기 위한 기술이 필요하다. 일반적인 배양법으로 2차원 부착배양법(Adherent Culture Method)과 3차원 부유배양법(Suspension Culture Method)을 들 수 있다. 이 중 후자가 Scale Up이나 고밀도 배양 면에서 뛰어나며, 대량배양에 적합하다고 여겨지고 있다. ES/iPS세포는 일반적으로 비부착 상태에서 부유배양하게 되면, 스페로이드(혹은 배상체(embryoid body))라고 불리는 공 모양의 세포덩어리를 형성하여, 비교적 안정적인 상태에서 효율적으로 증식 또는 분화시킬 수 있다.

기존에는 ES/iPS세포에 한하지 않고, 암세포 등 다양한 세포로부터 스페로이드를 형성시켜 부유배양하는 3차원 배양기술이 있으며, 그 때에는 저(低)부착 코팅된 평면접시나 U형∙V형 타입의 Multiwell Plate가 사용되었다. 평면접시를 이용한 경우는 파종 후의 세포와 세포가 접시의 흔들림이나 진동에 의해 접근, 세포 사이의 접착에 의해 응집하여 스페로이드를 형성한다. 그러나 이 경우는 응집하는 세포 수를 제어하는 것이 곤란하며, 재현성(再現性)이나 견고성이 약하여 숙련된 작업기술도 필요하게 된다. 한편, U형∙V형 타입의 Multiwell Plate의 경우는, well마다 파종한 세포가 응집하여 스페로이드를 형성하기 때문에, 스페로이드를 구성하는 세포 수를 제어하는 것이 가능하다. 그러나 작업 효율이나 배양용기의 공간 효율이 굉장히 나쁘고, 스페로이드의 대량형성 및 배양에는 적합하지 않다. 이러한 과제를 해결하기 위해, AGC Techno Glass사에서는 응집하는 세포 수를 제어하면서, 사이즈가 균일한 스페로이드를 고밀도로 대량 형성시키기 위한 미세가공용기 EZSPHERE®를 개발하여, 수년 전부터 시판하기 시작하였다.

AGC Asahi Glass에서는 최근 일본의료연구개발기구(AMED)의「재생의료실현거점 네트워크 프로그램」의 지원을 받아, EZSPHERE®을 이용하여 iPS세포의 스페로이드를 대량으로 형성∙배양하는 기술을 확립하였다. 또한 신경세포나 심근세포의 효율적인 분화유도에 대한 응용에도 성공하였다. 그리고 EZSPHERE®의 유니크한 미세가공 모양이나 미세 well 크기의 다양성을 활용한 스페로이드 배양∙분화방법을 개발하여, 분화유도에 걸리는 시간을 단축시키는 데도 성공하였다.

이를 통해 성립된, iPS세포로부터 균일한 스페로이드를 간편하고 효율적으로 대량 조제하고, 또한 효율적으로 분화시키는 기술은 향후 다양한 다능성 줄기세포의 3차원 배양 기반기술로서 활용될 것을 기대할 수 있다. 이들 연구개발 결과에 EZSPHERE®의 특징을 더하여 보고한다.

2. EZSPHERE®의 특징
EZSPHERE®는 이산화탄소레이저(Carbon Dioxide Laser) 조사(照射)에 의해, 폴리스티렌으로 만든 접시나 Multiwell Plate 등 배양용기의 배양 면에 빈틈없이 균일한 미세 well을 입힌 특수한 미세가공 배양용기다. 레이저 조사에 의해 형성된 미세 well은 절구모양의 유니크한 구조로 되어 있으며, 그 매끄러운 표면에는 단백질이나 세포의 부착을 억제하기 위한 저부착 코팅을 만들었다.

그 때문에 EZSPHERE®에 파종된 세포는 빠르게 각 미세 well 안에 균등하게 모여, 세포와 세포가 단시간에 응집함으로써 균일한 스페로이드를 형성한다. 또한 레이저 가공법의 특성을 활용하여, 레이저 강도 혹은 조사 시간을 조절함으로써 EZSPHERE®의 미세 well의 크기(구경∙깊이)를 플렉시블하게 조절하여 구경 약 200~1,400µm, 깊이 약 100~600µm의 범위에서 6종류의 미세 well 타입이 작성되어 있다. 이들 미세 well의 크기나 파종하는 세포의 수를 조절함으로써 스페로이드의 크기 제어를 간편하게 할 수 있다. EZSPHERE®에서는 용기 1장 당 미세 well의 밀도가 미세 well의 크기에 따라 달라진다.

예를 들면, 타입 900의 미세 well(구경 약 500µm, 깊이 약 100µm)은, 통칭 35mm 접시(배양면적 9㎠) 타입의 EZSPHERE®에서는 배양 면에 2,400개 이상 있는 한편, 통칭 100mm 접시(배양면적 55㎠) 타입의 EZSPHERE®에서는 배양 면에 14,000개 이상이나 있어, 스페로이드의 고밀도∙대량형성에 유효하다. 최근, AGC그룹 독자의 저부착 코팅제를 입힌 EZSPHERE®SP 제품시리즈가 개발되어, 재생의료에의 응용을 위한 평가 검토가 진행 중이다.

3. EZSPHERE®에서 인간 iPS세포 스페로이드의 고효율 형성
ES/iPS 세포 등 다능성 줄기세포로 형성된 스페로이드의 크기는 세포의 증식속도와 생존율뿐 아니라 분화 경향에도 큰 영향을 미친다고 알려져 있다. 따라서 EZSPHERE®를 이용하여 인간 iPS세포로부터 임의로 크기가 균일한 스페로이드를 단시간에 효율적으로 형성시키는 방법을 개발하였다.

iPS세포는 일반적으로 피더세포(Feeder cell)나 매트리젤(Matrigel) 등의 토대 위에서 2차원 부착배양함으로써 단층의 2차원 Colony를 형성한다. 그 Colony를 효소처리를 통해 Single Cell로 분산하고 나서 EZSPHERE®에 파종하면, 단시간(3~4시간)에 크기가 균일한 스페로이드를 형성한다는 사실을 알게 되었다. iPS세포는 일반적으로 Colony 혹은 스페로이드 상태에서 Single Cell로 분산하게 되면, 생존율이 현저하게 저하하는 경향이 있다. 그러나 EZSPHERE®에 파종한 Single Cell에 분산한 iPS세포는 단시간에 응집하여 신속하게 스페로이드를 형성하기 때문에, 세포가 받는 손상은 줄고, 높은 생존율을 유지한다고 추측된다.

실제로 세포의 생사판정용 형광염색법으로 세포 생존율을 분석한 결과, 스페로이드 형성 직후에 있어서도 높은 세포 생존율이 확인되었다. 또한, EZSPHERE®의 미세 well 크기와 파종하는 세포 수의 조합에 의해, 형성되는 스페로이드의 크기가 엄밀하게 컨트롤 가능하다는 사실을 확인하였다. 이처럼 EZSPHERE®은 크기가 임의로 균일한 iPS세포 스페로이드를 단시간에 대량으로, 그리고 높은 생존율로 형성 가능하다는 사실이 확인되었다.

4. EZSPHERE®에서 iPS세포 스페로이드의 미분화 유지 증식
EZSPHERE®에서 형성한 iPS세포 스페로이드에 대해, 그것을 구성하는 세포 본래의 다능성(미분화 상태)을 유지한 채 안정적이며 효율적으로 증식시키는 방법을 검토하였다. iPS세포는 보통의 체세포 등과 비교하여 대사활성이 높다는 이유도 있어, 일반적으로는 매일 배지를 교환할 필요가 있었다. 그러나 EZSPHERE®의 경우는 용기의 특성에 맞추어 매일 절반만 배지를 교환하는 방법을 이용하였다.

이을 통해 스페로이드가 배지교환 단계에서 각 미세 well에서 튀어나오는 일 없이, 미세 well의 안에서 안정적이며 효율적으로 성장하여, 파종 후 4~5일간 세포 수가 7~10배 이상 증가한다는 사실을 관찰할 수 있었다. 증식한 iPS세포는 98% 이상의 높은 비율로 다능성 마커(OCT4, SOX2, SSEA3) 양성률을 나타내고 있으며, 본래의 다능성(미분화 상태)을 유지한 채 효율적으로 증식이 가능하다는 사실이 확인되었다. 이들 결과를 통해 EZSPHERE®가 iPS세포의 고효율의 스페로이드 형성뿐 아니라, 다능성 유지상태에서 안정적이며 효율적으로 증식시키데 있어서도 뛰어나다는 사실을 알았다.

5. EZSPHERE®에서 iPS세포 스페로이드의 효율적인 분화 유도
ES/iPS세포 등 줄기세포의 재생의료 또는 신약개발 분야에 응용하기 위해서는, 대량의 세포를 조제하여 그것을 목적의 세포로 효율적으로 분화시키는 것이 필요하다. 예를 들면, 척수손상이나 파킨슨병 등의 세포치료로 기대를 모으고 있는 신경계 세포의 근본이 되는 신경줄기세포는, 일반적으로는 96혈형(穴型) Multiwell Plate 타입의 스페로이드 형성 용기를 사용하여, 스페로이드 당 9,000개의 iPS세포를 저분자(Low Molecular Weight) 저해제(Inhibitor)와 함께 3차원 부유배양함으로써 분화 유도되고 있다.

우리들은 이 프로토콜에 EZSPHERE®가 적응 가능한가를 검토하였다. 그 검토에서는 iPS세포의 파종 밀도나 스페로이드 크기가 신경 분화 효율에 크게 영향 받을 가능성을 염두에 두고, EZSPHERE®에 대한 세포 파종 밀도를 미세 well 당 125~1,000개의 범위에서 흔들어, 파종 밀도나 스페로이드 크기와 분화 효율의 관련성도 포함하여 조사하였다.

그 결과, 우선 형성한 스페로이드 크기는 파종 세포 수에 의존하며, 양자 간에서 높은 상관성이 확인되었다. 또한 세포 파종 후에 신경 분화 유도용 배지에서 배양한 스페로이드를 1, 3, 5일째의 시점에서 각각 회수하여, 일단 Matrigel Coat Plate로 옮겨, 부착상태에서 신경줄기세포 및 신경세포의 비율을 면역형광염색 방법으로 조사하였다. 흥미롭게도 미세 well 당의 파종 세포 수가 500~1,000개의 조건에서 형성시킨 큰 스페로이드는 분화 유도 3일째에는 거의 모든 세포가 신경줄기세포 마커(Nestin) 양성이 되고, 5일째에는 신경세포 마커(βⅢ-tubulin) 양성 세포도 확인되었다. 한편, 미세 well 당 파종 세포 수가 125~250개의 조건에서 형성시킨 작은 스페로이드는 분화 효율이 낮았다. 이들 결과로부터 신경분화 속도의 스페로이드 크기∙밀도 의존성이 강하게 시사되었다.

이 현상을 보다 상세하게 조사하기 위해, 상기의 분화 유도 과정에 있어서 신경줄기세포에 대한 분화율을 유세포분석기(Flow cytometry)로 정량적으로 분석하였다. 그 결과, 분화 유도 4일째 시점에서는 스페로이드 크기에 관계없이 신경 외배엽(ectoderm)까지는 분화가 진행되었다. 한편 그 후의 신경 외배엽부터 신경줄기세포까지의 분화 효율은 스페로이드 크기에 크게 의존하며, 큰 스페로이드 쪽에서 분화가 촉진된다는 것을 알았다.

이들 결과를 통해, EZSPHERE®를 이용한 신경 분화 유도 때에는, 세포 파종 밀도를 올려 큰 스페로이드를 형성시킴으로써 신경 외배엽부터 신경줄기세포에 대한 분화를 가속시킨다는 사실을 발견하였다. 이처럼 EZSPHERE®를 이용함으로써, 기존의 방법으로는 시험해 볼 수 없었던, 스페로이드의 크기나 밀도에 의존한 분화의 방향성이나 효율∙속도의 해석이 가능하게 되었다.

6. EZSPHERE®에서 iPS세포의 3차원 배양∙증식부터 도파민 신경분화∙성숙화까지 일관된 프로세스의 달성
위에서 말한 것처럼, EZSPHERE®이 iPS세포의 스페로이드 형성부터 증식까지, 또한 신경 분화 유도까지의 일련의 프로세스에 응용 가능하다는 사실을 통해, 이들 일련의 프로세스를 동일한 EZSPHERE® 용기 상에서 일관되게 실시 가능한지를 조사해 보았다. 그 실험에서는, 부착배양에 대한 분화 프로토콜이 이미 확립되어 있는 도파민 신경 분화 프로세스를 모델로 하여, 최종적으로 얻을 수 있는 도파민 신경의 성숙 정도는 도파민 분화량을 지표로 확인하였다.

그 결과, EZSPHERE®를 이용하여 iPS세포의 스페로이드 형성부터 증식까지, 또한 도파민 신경계 세포에 대한 분화유도부터 성숙화까지의 일련의 공정을 동일 용기 안에서 완결 가능하다는 것을 확인하였다. 도파민 신경세포는 파킨슨병의 근본적인 치료법으로서 기대되고 있기 때문에, EZSPHERE®가 그에 응용 가능하다고 생각할 수 있다.

이상의 결과를 통해, EZSPHERE®를 사용함으로써 iPS세포 등 다능성 줄기세포를 2차원 부착배양할 때와 비교해 보면, 고밀도로 3차원 배양할 수 있기 때문에 공간을 절약할 수 있다. 또한 스페로이드의 형성∙배양부터 분화유도∙성숙화까지의 일련의 공정을 일관되게 실시할 수 있는 심플한 프로세스가 실현 가능하다는 사실을 나타냈다. 이와 같은 일련의 공정은 장기적으로는 자동 배양장치에 대한 적응도 용이하여, 산업화로 이어질 것이 기대된다.

7. EZSPHERE®의 심근분화에의 응용
EZSPHERE®가 iPS세포의 신경 분화 유도 이외의 분화 공정에 대한 응용 가능성에 대해서도 심근분화를 모델로 하여 조사하였다. iPS세포에서 나온 심근세포는 심근경색 등의 재생의료나 심질환기구 해명의 용도뿐만 아니라, 심독성(Cardiotoxicity) 평가 등 신약 개발에의 응용이 기대되며, 연구가 활발하게 이루어지고 있다. iPS세포로부터의 심근분화 유도의 경우에도 신경분화와 마찬가지로 스페로이드 배양법이 일반적으로 사용되고 있기 때문에, EZSPHERE®의 적용성을 검토하였다.

iPS세포에서 심근으로 분화될 때는 Wnt 시그널의 제어(활성화 또는 억제)가 중요하기 때문에, 심근분화 유도의 초기단계에서는 Wnt 시그널을 활성화시키는 성장인자를 첨가하면서, EZSPHERE®에서 iPS세포 스페로이드의 형성부터 중배엽(mesoderm) 분화까지 실시하였다. 그 후에, Wnt 시그널을 완전히 블록할 필요가 있기 때문에, 완전히 배지를 교환할 목적으로 스페로이드를 평면 저부착 배양용기로 옮겨, Wnt 시그널을 저해하는 화합물을 첨가하면서 부유배양을 계속하여 심근분화를 유도하였다.

그 결과, EZSPHERE®에서 형성한 균일한 사이즈의 스페로이드에서 분화시킨 심근세포는, α-actinin의 형광면역염색 해석에 의해 심근세포 특유의 내부구조인 Sarcomere구조를 나타냈다. 또한 Flow Cytometry에서 심근 마커(Cardiac Toroponin T) 양성률이 88%로 높고, EZSPHERE®를 사용함으로써 기존의 방법과 동등 이상의 효율로 심근분화가 가능하다는 사실을 확인하였다. 향후, 심근분화의 모든 과정에서 EZSPHERE®의 이용 확대가 기대된다.

8. 정리와 향후 전개
ES/iPS세포 등 다능성 줄기세포를 재생의료나 신약 개발에 활용하기 위해서는, 균일한 성질을 갖는 미분화 세포를 저비용으로 간편하게 대량 조제하여, 효율적으로 분화 유도하는 방법이 중요하다. 유니크한 미세 모양을 갖는 미세가공 배양용기 EZSPHERE®를 이용한 3차원 배양법에 의해, iPS세포 등 줄기세포의 스페로이드 형성부터 세포 증식, 분화 유도, 성숙화까지의 일련의 공정을 효율적으로 시행하는 것이 가능하다는 것을 본 연구를 통해 확인되었다. 본 기술은, iPS세포 등 줄기세포를 간편하게 저비용∙고품질로 대량배양∙분화하는 플랫폼 구축에 기여할 것이 기대된다.

앞으로는 EZSPHERE®의 대형화, 자동화 시스템에의 도입을 통해, 재생의료의 실용화 및 산업화에 중요한 3D배양∙분화용기로서의 응용 및 전개가 기대된다.

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